SEM w badaniach biomedycznych struktura zakrzepu w naczyniach

SEM jest uniwersalnym narzędziem do obrazowania powierzchni, a przy odpowiedniej preparatyce umożliwia też ocenę przekroju czy trójwymiarową analizę komórek, tkanek, biomateriałów oraz różnych struktur biologicznych. Pojawienie się na rynku kompaktowych mikroskopów skaningowych umożliwiło szersze zastosowanie tego typu analiz, nie tylko w wysokospecjalistycznych jednostkach naukowych, ale również w szpitalach klinicznych, w których prowadzone są badania naukowe. 
 
Skrzeplina
 
Od niedawna w Krakowskim Centrum Badań i Technologii Medycznych w Szpitalu im. Jana Pawła II działa kompaktowy skaningowy mikroskop elektronowy marki JEOL JCM-6000 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan). Jest to jeden z najbardziej zaawansowanych stołowych SEMów, waży zaledwie 50 kg i może być zasilany ze standardowego gniazda elektrycznego. Mikroskop ten nie wymaga specjalnych pomieszczeń ani stołów – jest przystosowany do pracy na biurku mogącym unieść obciążenie 100 kg. Wyposażony jest w wolframowe działo termoemisyjne umożliwiające osiągnięcie powiększeń do 60000x. Ponadto ma możliwość analizy materiału w warunkach niskiej i wysokiej próżni, jak również przy zmiennych napięciach. Jest prosty w obsłudze, posiada czytelny i intuicyjny graficzny interfejs użytkownika. Obsługa mikroskopu, obserwacja i rejestracja obrazu możliwa jest za pomocą jednego kliknięcia panelu dotykowego. Niemniej jednak mikroskop ten posiada pewne ograniczenia, a mianowicie SEMy z wolframowym TEG cechuje najniższa jasność obrazu oraz najniższa zdolność rozdzielcza. Również filamenty wolframowe wykazują najkrótszą żywotność ze wszystkich konkurencyjnych dział. 

W Krakowskim Centrum Badań i Technologii Medycznych SEM stosowany jest przede wszystkim do oceny struktury skrzepów fibrynowych wytworzonych z osocza pacjentów obciążonych ryzykiem wystąpienia powikłań zakrzepowo-zatorowych. Ponadto SEM można wykorzystać do obrazowania budowy morfologicznej skrzeplin usuniętych z tętnic wieńcowych u chorych z ostrym zawałem mięśnia sercowego (zabieg taki zwany trombektomią poprawia rokowanie u tych pacjentów), czy z tętnic płucnych od pacjentów z zatorowością płucną dużego ryzyka, jeśli konieczne jest wykonanie zabiegu operacyjnego usunięcia materiału zatorowego z naczyń. 
 
 
Skrzepliny

Końcowym etapem krzepnięcia krwi, procesu niezbędnego do zatrzymania krwawienia z uszkodzonego naczynia, jest powstanie stabilnego skrzepu złożonego z cienkich nitek fibryny (włóknika). Skrzep fibrynowy z uwięzionymi jak w sieci czerwonymi i białymi ciałkami krwi oraz płytkami krwi niczym korek uszczelniając uszkodzone naczynie hamuje krwawienie, przez co pozwala na utrzymanie odpowiedniej objętości krwi w łożysku naczyniowym. W warunkach chorobowych może dochodzić do powstawania skrzeplin w naczyniach krwionośnych – żylnych lub tętniczych – wskutek uszkodzenia ściany naczynia np. przez stan zapalny lub ucisk. Zjawisko to nazywane jest zakrzepicą. Taki proces jest najczęstszą przyczyną zgonu w Europie powodując większość zawałów serca i duży odsetek udarów mózgu, a także zatorów tętnic płucnych. 

Materiał zakrzepowy do analizy za pomocą SEMu utrwala się w 2,5% aldehydzie glutarowym przez 4-12 godzin, następnie przepłukuje buforem fosforanowym o pH=7.4 i odwadnia w kolejnych roztworach alkoholu etylowego o rosnącym stężeniu procentowym. Po odwodnieniu próbek konieczne jest poddanie ich procesowi suszenia: w punkcie krytycznym po wprowadzeniu ciekłego dwutlenku węgla lub poprzez sublimację w próżni po uprzednim zamrożeniu próbki w alkoholu tert-butylowym. Tak przygotowany materiał przyklejany jest do uchwytu mikroskopowego za pomocą taśmy węglowej i napylany złotem. Dzięki powyższym procedurom badana próbka może przewodzić prąd elektryczny, przynajmniej na swojej powierzchni i może być uziemiona, co zapobiega gromadzeniu się ładunków elektrostatycznych. Po przeprowadzonej analizie powierzchni próbki wiązką elektronów możliwe jest nałożenie na otrzymany obraz siatki kilkuset kwadratów o wybranej długości boku i wzrokowa ocena rodzaju struktur biologicznych występujących w kolejnych polach siatki. Badania materiału zakrzepowego pochodzącego z tętnic wieńcowych (fot. 1) od pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego wykonane przy użyciu SEM pozwoliły określić, że fibryna stanowi główny składnik skrzepliny (około 50%), a jej zawartość wzrasta w miarę upływu czasu od początku bólu zawałowego (średnio od 30% w zawale serca, jeśli od początku bólu w klatce piersiowej minęło <3h, do 80% gdy objawy rozpoczęły się >12h przed zabiegiem usunięcia skrzepliny z tętnicy wieńcowej, fot. 2 A, B). Skrzepliny pochodzące od chorych ze świeżym zawałem serca zawierają także więcej erytrocytów niż te od pacjentów, u których stwierdzono zawał mięśnia serca kilkanaście godzin po wystąpieniu pierwszych objawów (odpowiednio od 31% do 2%).  

Niejednokrotnie SEM pozwala na cyfrową rejestrację struktur lub zjawisk niemożliwych do zbadania za pomocą większości standardowych metod czynnościowych. Takim przykładem może być opisane po raz pierwszy w 2014 roku zjawisko powstawania erytrocytów wielościennych zwanych polihedrocytami. Kształt wielościanu minimalizuje energię potencjalną układu i zapewnia optymalne ułożenie erytrocytów w skrzeplinie. Komórki wielościenne powstają w wyniku kontrakcji (inaczej retrakcji) skrzepliny polegającej na zmniejszaniu objętości zakrzepu dzięki siłom generowanym przez płytki krwi. Zjawisko to jest szczególnie nasilone w naczyniach, w których przepływ krwi jest całkowicie zablokowany przez skrzeplinę i ma na celu udrożnienie światła zatkanej tętnicy. 

Do chwili, w której udokumentowano na modelach in vitro występowanie komórek polihedralnych w skrzepach wytworzonych z pełnej krwi, ich obecność uważano za artefakt powstający w trakcie preparatyki próbek. Polihedrocyty obserwowane są w niektórych skrzeplinach z tętnic wieńcowych, a ich obecność w świeżym zawale serca związana jest z wyższą, ale wciąż w granicach normy liczbą erytrocytów we krwi obwodowej, większą zawartością erytrocytów w skrzeplinie czy też większą liczbą zmian miażdżycowych w danej tętnicy (fot. 3 A). Badania materiału zatorowego z tętnic płucnych wykonane przy pomocy SEMu pozwoliły zaobserwować, że dystalne części skrzepliny są bogatsze w gęsto upakowane włókna fibryny i zawierają więcej krwinek białych, a mniej erytrocytów niż proksymalne części skrzepliny czy też skrzeplina z przedsionka serca (fot. 3 B). W mniejszych naczyniach obserwowano ułożenie włókien fibryny zgodnie z wektorem przepływu krwi. Tego typu spostrzeżenia mogą pomóc wyjaśnić występowanie oporności na terapię przeciwzakrzepową u niektórych pacjentów z zatorowością płucną. 
 
 
Erytrocyty

Fibryna jest głównym składnikiem białkowym nie tylko skrzeplin powstających w tętnicach wieńcowych czy płucnych, ale także skrzepów tworzonych in vitro do badań eksperymentalnych. Przeciętna grubość włókien fibryny u człowieka mieści się w zakresie od 85 do 200 nm. U większości ssaków włókna fibryny są cieńsze niż u ludzi, u myszy zakres ten waha się w granicach 20-40 nm. Zauważono, że niekorzystne właściwości morfologiczne skrzepu fibrynowego (powstawanie cienkich włókien fibryny z niewielkimi porami pomiędzy nimi) wiążą się z takimi chorobami jak: udar mózgu, zawał mięśnia sercowego, żylna choroba zakrzepowo-zatorowa, choroba tętnic obwodowych, przewlekła obturacyjna choroba płuc, mnogie nowotwory złośliwe, cukrzyca czy reumatoidalne zapalenie stawów. U pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego stwierdzono istotną korelację pomiędzy zawartością fibryny w skrzeplinie, a porowatością skrzepu wytworzonego in vitro. U chorych z cukrzycą zauważono pogarszające się właściwości skrzepu fibrynowego w miarę dłuższego trwania choroby. 

Dzięki badaniom fenotypu skrzepu fibrynowego w różnych jednostkach chorobowych możliwa była identyfikacja szeregu czynników genetycznych i środowiskowych modyfikujących właściwości fibryny takich jak: mutacja genu V czynnika krzepnięcia (typ Leiden), mutacje genów kodujących łańcuchy cząsteczek fibrynogenu (np. powodujące dysfibrynogenemie), poziom fibrynogenu, lipoproteiny (a), homocysteiny, glukozy, białka C-reaktywnego, palenie tytoniu, przyjmowanie aspiryny, statyn czy leków antykoncepcyjnych. W przypadku, gdy osoczowy model skrzepu wydaję się być zbyt skomplikowanym do jednoznacznego określenia głównego czynnika powodującego jego modyfikację, możliwe jest użycie czystego fibrynogenu wyizolowanego z ludzkiego osocza i zbadanie wpływu pojedynczych substancji, jak aktywne formy leków, na właściwości fibryny. Skrzepy fibrynowe wysoce odporne na enzymatyczną degradację czyli zbudowane z drobnych i gęsto ułożonych włókien są zazwyczaj związane z zaburzeniami zakrzepowo-zatorowymi, natomiast skrzepy niestabilne o luźnej strukturze i grubszych włóknach z epizodami krwotocznymi. Analiza za pomocą SEM pozwala dodatkowo na pomiar grubości włókien oraz wielkości porów pomiędzy nimi. Niekorzystnie zmodyfikowane właściwości skrzepu fibrynowego mogą być więc czynnikiem ryzyka dla wystąpienia epizodów zakrzepowo-zatorowych. Podobne właściwości skrzepów fibrynowych występujące w jednostkach chorobowych związanych z układem żylnym i tętniczym stanowią pośredni dowód dla koncepcji zakładającej, że patofizjologia chorób zakrzepowo-zatorowych niezależnie od ich lokalizacji jest bardzo podobna. 

Szeroka dostępność, miniaturyzacja i stosunkowo łatwe w obsłudze oprogramowanie mikroskopów elektronowych połączone ze stosowaniem zoptymalizowanych procedur pozwalających na szybkie przygotowanie próbek umożliwiają ocenę budowy morfologicznej struktur biologicznych w ciągu kilku godzin od rozpoczęcia preparatyki. Skaningowa mikroskopia elektronowa ma coraz szersze zastosowanie w badaniach biomedycznych, w których stanowi solidną dokumentację zjawisk badanych przy użyciu metod czynnościowych, jak również zjawisk niemożliwych do opisania innymi metodami.



Ostatnio opublikowane artykuły w kategorii Diagnostyka obrazowa:

Elektroniczna dokumentacja medyczna czyli jak ugryźć ucyfrowienie RTG – nowości Rayence

Postęp, zmiany i innowacje to nieodłączne cechy intensywnie rozwijających się dziedzin nauki, technologii i medycyny. Inwestycje w nowe technologie są naturalną drogą zwiększenia przychodu i polepszenia jakości usług. Pomimo wynalezienia na początku lat 60-tych pierwszego detektora, umożliwiającego przechwycenie promieniowania w formie cyfrowej, wiele placówek w Polsce – ze względów finansowych – nadal korzysta z systemów analogowych.

Bezpieczeństwo pacjenta podczas zabiegów radioterapii

Choroby nowotworowe obok chorób układu krążenia są główną przyczyną zgonów na świecie. Z roku na rok zwiększa się zachorowalność na nowotwory, a w związku z postępem medycyny i jej możliwości diagnostycznych wzrasta także ich wykrywalność. Jest to powodem bardzo dużego wzrostu liczby pacjentów objętych leczeniem onkologicznym. Ważnym elementem procesu leczenia onkologicznego jest radioterapia wykonywana w seriach zabiegów, które wcześniej zostają szczegółowo zaplanowane tak, aby działania niepożądane i ewentualne uszkodzenia okolicznych dla guza tkanek były jak najmniejsze. 

Leczenie zaburzeń pracy serca - gwarancja bezpieczeństwa z systemem Epoch

Będąc dystrybutorem firmy Stereotaxis na Polskę bardzo nam miło jest przedstawić wyniki badań udostępnione przez Uniwersytet Medyczny Paracelcus na temat korzyści płynących ze stosowania systemu Niobe. 

Ucyfrowienie aparatu RTG – to naprawdę proste

Cyfrowe aparaty RTG stały się już standardem. Na rynku medycznym pozostaje jednak wiele systemów analogowych, które pomimo swojego stażu bardzo dobrze funkcjonują. Do niedawna jedyną opcją ucyfrowienia takich aparatów były kasety CR (Computed Radiography) - czyli systemy Radiografii Cyfrowej Pośredniej. Aktualnie pracownie mają do wyboru również bezpośrednią digitalizację systemów RTG, poprzez detektory DR (Digital Radiography) - czyli Radiografię Cyfrową Bezpośrednią. O tej technice będą Państwo mogli przeczytać w poniższym artykule. 

W CX News nr 4/50/2014 opublikowano również: