Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna ex vivo do szybkiej oceny tkanek w praktyce patologii chirurgicznej
Obrazowanie optyczne jest szybko ewoluującą dziedziną, która obejmuje kilka technik stosowanych do nieinwazyjnego obrazowania próbek tkanek biologicznych. W przeciwieństwie do innych rodzajów obrazowania, metoda ta wykorzystuje światło widzialne oraz właściwości fotonów do uzyskania szczegółowych obrazów tkanki, bez narażenia jej na szkodliwe promieniowanie. Platformy do obrazowania optycznego są bezpieczniejsze, szybsze, nadają się do powtórzenia procedury w późniejszym czasie. Techniki, takie jak laserowa endomikroskopia konfokalna oraz optyczna tomografia koherentna, pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym narządów in vivo, umożliwiając wczesne wykrycie zmian. Ponadto, te techniki obrazowania również ułatwiają pozyskiwanie ukierunkowanych biopsji w celu lepszej kategoryzacji zmiany.
W badaniu pilotażowym przetestowano możliwość użycia platformy CFM (ConFokal Microscopy) do obrazowania ex vivo próbek tkanek uzyskanych z resekcji. Głównym celem badania było sprawdzenie zdolności platformy CFM do generowania obrazów pobranych próbek tkanek i porównanie z obrazami wybarwionymi hematoksyliną-eozyną (H&E).
Materiały i metody
Badania zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Teksańskim, MD Anderson Cancer Center w Houston, przy użyciu wspomnianych powyżej próbek tkanek, które zostały przyjęte do laboratorium histopatologicznego.
Fragmenty świeżej tkanki mierzącej od 0.5x0.5 cm do 1.5x1.5 cm o grubości w zakresie od 0.2 cm do 0.5 cm, zebrano zarówno z prawidłowych struktur, jak i z obszarów nowotworu, podczas 55 resekcji złośliwych nowotworów piersi, wątroby, płuc i nerek, wkrótce po zakończeniu bezpośredniej, śródoperacyjnej oceny próbek chirurgicznych. Próbki przed obrazowaniem przechowywano w wilgotnej, izotonicznej soli buforowanej fosforanem (pH 7.4). Obrazowanie wykonano w ciągu 1 godziny od pobrania materiału. Świeże próbki tkanek barwiono 0.6 mM oranżem akrydyny przez 1 minutę w celu wybarwienia jądra i otrzymania niezbędnego kontrastu dla rozpoznania architektury tkanki. Oranż akrydyny to barwnik fluorescencyjny, który wiąże się preferencyjnie z jądrowym DNA i był stosowany również jako środek kontrastowy w poprzednich badaniach CFM.
Obrazy próbki uzyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego (Vivascope® 2500, Calibre Imaging and Diagnostics Inc, Rochester, New York), zaprojektowanego specjalnie do obrazowania ex vivo świeżych próbek tkanek biologicznych. System składał się m.in. z lasera diodowego o długości fali 488 nm. Przy założonych ustawieniach rozdzielczość poprzeczna wynosiła 1.0 lm, a rozdzielczość osiowa była mniejsza niż 5.0 lm. Obrazy pozyskiwano z szybkością 9 klatek na sekundę. Wszystkie zeskanowane obszary zostały uchwycone jako kwadratowe obrazy konfokalne o wymiarach 630x630 lm, zostały złożone w celu utworzenia mozaiki obrazów całej tkanki. Powstały obraz kompozytowy mierzył do 2 cm w największej średnicy. Złożone zdjęcia zostały wychwycone na dwóch różnych głębokościach osiowych, w tym jednej z powierzchni, a drugiej na głębokości 200 lm pod powierzchnią tkanki.
Po zakończeniu obrazowania, tkankę natychmiast utrwalono w 10%, obojętnej buforowanej formalinie, później poddano ją rutynowej obróbce i osadzono w parafinowym wosku w celu wytworzenia bloków tkanek. Następnie bloki tkanek pocięto na grubość 5 ml i wybarwiono metodą H&E dla konwencjonalnego badania histopatologicznego. Złożone zdjęcia CFM dla każdej próbki zostały szczegółowo zbadane w różnych skalach, aby rozpoznać tkanki w połączeniu z konwencjonalnym badaniem histopatologicznym wycinków tkanki H&E.
Wyniki
Zobrazowano 55 próbek tkanek, które uzyskano z resekcji piersi (16; 29%), płuc (18; 33%), nerek (14; 25%) i wątroby (7; 13%). Mozaiki obrazów w skali szarości CFM zostały pozyskane w ciągu 5 do 10 minut. Interpretacja mozaik CFM fragmentów tkanek, w tym badanie obrazów przy wyższych powiększeniach dla podstawowej kategoryzacji tkanki na łagodne i złośliwe oraz dla uzyskania podstawowej diagnozy histologicznej, została osiągnięta w ciągu od 3 sekund do 5 minut. Nie było różnicy w obrazach generowanych na dwóch osiowych głębokościach.
Mozaiki obrazów umożliwiły rozpoznanie tkanki jako normalnego miąższu odpowiednich narządów w 28 przypadkach (51%), łagodnego guza w 1 przypadku (2%) i złośliwego w 26 przypadkach (47%). Zdjęcia CFM w odcieniach szarości wyglądały bardzo podobnie do sekcji tkanek H&E. Obszary ogniskowe w mozaice obrazów CFM wykazywały brak ostrości, zaobserwowano ciemne obszary, co sugerowało brak przenikania światła do ogniskowych obszarów obrazu w tkance. Problemy te odnotowano jedynie w niewielkich ogniskach na obrazach CFM. Obrazy w skali szarości CFM miały wymaganą rozdzielczość dla interpretacji i rozpoznawania architektury tkanki oraz cech cytomorfologicznych. Zabarwione oranżem akrydyny jądro komórkowe, stworzyło niezbędny kontrast między jądrowym i cytoplazmatycznym obszarem komórki, pomagając w rozpoznaniu architektury tkanki.
Dyskusja
Technika CFM ma kilka zalet w porównaniu z analizą zamrożonych przekrojów, która jest najczęściej stosowaną procedurą w praktyce patologii chirurgicznej do szybkiego badania fragmentów tkanki. Procedura zamrażania i wycinania zamrożonego bloku tkankowego w kriotomie, a następnie barwienia go w celu wykonania badania histopatologicznego w zamrożonym zestawie sekcji może trwać od 20 do 30 minut. Ponadto proces zamrażania powoduje artefakty, które mogą zagrozić optymalnej konserwacji próbki tkanki. Technika CFM znajdzie zastosowanie w szybkiej ocenie jakości biopsji rdzeniowych, które na ogół nie podlegają zamrożeniu. Sekcje optyczne fragmentów tkanki mogą być dostępne do oglądania z wykorzystaniem techniki CFM w akceptowalnym czasie dla oceny śródoperacyjnej tkanki lub podczas zabiegów radiologii interwencyjnej. Jakość obrazów CFM umożliwiła rozpoznanie tkanki i była porównywalna z konwencjonalnym badaniem histopatologicznym odpowiednich odcinków tkanek H&E. Ponadto należy zauważyć, że technika CFM wymagała minimalnego przygotowania i nie spowodowała żadnej utraty tkanki, w przeciwieństwie do analizy przekrojów w stanie zamrożonym.
Podsumowując, względna łatwość i szybkość pozyskiwania obrazów w skali szarości wraz z jakością obrazów uzyskanych za pomocą platformy CFM użytej w naszym badaniu sugerują, że ta technika ma szansę na zastosowanie w praktyce patologii chirurgicznej. Doświadczenie mające na celu wykazanie integralności tkanek w pomocniczych badaniach genomowych i proteomicznych będą miały zasadnicze znaczenie dla wykorzystania potencjału tej obiecującej technologii, jako odtwarzalnej i niezawodnej platformy do szybkiego badania próbek tkanek w rutynowych praktykach chirurgicznej patologii.
Więcej informacji na temat mikroskop konfokolay, rak skóry, nowotwór skóry, diagnostyka czerniaka znajdziecie Państwo na stronie firmy CONSULTRONIX S.A.